ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 22993—2008 牛奶和奶粉中八种镇定剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of eight tranquillizers residues in bovine milk and milk powder- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22993—2008 前言 本标准的附录A、附录 B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：宋文斌、李一尘、李军、隋凯、董振霖、李百、王旭、赵守成、庞国芳 GB/T22993—2008 牛奶和奶粉中八种镇定剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 peridol）、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪（propionylpromazine）、甲苯噻嗪（xylazine）、阿扎哌隆（azaperone）及其 代谢物阿扎哌醇（azaperol)和β-阻断剂咔唑心安（carazolol）残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于牛奶和奶粉中乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎 哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安残留量的测定。 本标准方法检出限：牛奶中乙酰丙嗪、氯丙嗪、丙酰二甲氨基丙盼噻嗪、咔唑心安均为0.5ug/L，甲 苯噻嗪为0.25μg/L，阿扎哌隆为0.2μg/L,阿扎哌醇为0.15μg/L，氟哌啶醇为0.1μg/L，奶粉中乙 酰丙嗪、氯丙嗪、丙酰二甲氨基丙噻嗪、咔唑心安均为4.0ug/kg，甲苯噻嗪为2.0μg/kg,阿扎哌隆为 1.6μg/kg，阿扎哌醇为1.2μg/kg，氟哌啶醇为0.8μg/kg 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研 究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.12004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2：1994,IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD） 3原理 样品在碱性条件下用特丁基甲醚提取，提取液用磷酸盐缓冲液调成酸性，弃去有机相，水相再调成 碱性用特丁基甲醚净反萃后浓缩定容，进行液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水 4.1乙腈：色谱纯。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3无水乙醇：色谱纯。 4.4盐酸：优级纯。 4.5特丁基甲醚。 4.6氢氧化钠。 4.7 氢氧化钠溶液：5mol/L。称取50.0g氢氧化钠（4.6）用水溶解，定容到250mL。 4. 8 磷酸二氢钾。 4.9 磷酸二氢钾溶液：1mol/L，pH=3.0，称取68.045g磷酸二氢钾（4.8）用水溶解，用盐酸（4.4)将 1 GB/T22993—2008 溶液的pH值调至3.0，定容到500mL。 4.10甲酸铵 4.11甲酸：色谱纯。 pH值调至4.0,定容至1000mL。 4.13甲酸铵缓冲液：0.01mol/L，pH=4.0,取甲酸铵缓冲液（4.12）100mL用水稀释定容到 1 000 mL。 4.14流动相A：0.01mol/L甲酸铵缓冲液，pH=4.0（4.13），通过0.2μm过滤器过滤。 4.15流动相B:乙睛（4.1)通过0.2μm过滤器过滤。 4.16流动相C:甲醇（4.2)通过0.2μm过滤器过滤。 4.17混合流动相：将70mL流动相A，15mL流动相B以及15mL流动相C混合。 4.18镇定剂及其代谢物和β-阻断剂的标准物质：乙酰丙嗪·马来酸，纯度大于等于99%；阿扎哌隆， 纯度天于等于99%；咔唑心安，纯度：99%；氯丙嗪·盐酸，纯度：99%氟哌啶醇，纯度大于等于99%； 丙酰二甲氨基丙盼噻嗪盐酸，纯度：98%；甲苯噻嗪·盐酸，纯度：99%；阿扎哌醇，浓度10.0ug/mL (甲醇)。 4.19八种镇定剂标准储备溶液 4.19.1乙酰丙嗪、阿扎哌隆、咔唑心安、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪标准储备 溶液：0.10mg/mL。称取适量的上述标准物质（4.18），分别用无水乙醇（4.3），配成0.10mg/mL的标 准储备液。储备液避光在2℃～4℃条件下贮存。每年配制一次。 4.19.2阿扎哌醇标准储备溶液：1.0μg/mL。准确移取1.0mL阿扎哌醇标准液（4.18）于10mL容量 瓶中，用无水乙醇（4.3)定容至刻度，混匀，配成1.0μg/mL的标准储备液。储备液避光在2℃～4℃条 件下贮存。每年配制一次。 4.20八种镇定剂混合标准储备溶液：量取适量的6种镇定剂及其代谢物标准储备溶液（4.19.1和 4.19.2），用乙睛配制成混合标准储备溶液。在2℃～4℃条件下贮存。 品提取液配成不同浓度的混合标准工作溶液。在2℃～4℃条件下避光贮存 注：称取标准物的质量是按纯度和含盐量修正过的质量。 5仪器 5.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾的离子源。 5.2电子天平：感量0.1mg和0.1g。 5.3离心机：最大转速为10000r/min。 5.4离心管：锥形底玻璃离心管，15mL和10mL具塞；锥形底聚丙烯离心管，50mL，具螺旋盖。 5.5 过滤器：聚四氟乙烯过滤器，0.2μm×13mm；尼龙薄膜过滤器，0.2um×47mm。 5.6 液体分配器：lmL～10mL和5mL～50mL。 5.7 5.8 流动相过滤装置。 5.9氮气浓缩仪。 5.107 高速涡流混合器。 5.11振荡器。 5.12 一次性移液管。 5.13酉 酸度计：测量精度为土0.02。 5.14超声波仪。 2 GB/T22993—2008 5. 15 一次性注射器：1mL。 5.16试样瓶:2.0mL。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 将牛奶和奶粉样品分别混合均匀。各自分出0.5kg作为试样，将分出的试样密封，并作上标记。 6.2试样保存 将试样置于4℃条件下贮存。 7测定步骤 7.1提取 7.1.1牛奶样品 称取牛奶试样2.00mL精确到0.01mL，放人50mL聚丙烯离心管中，加人200μL乙睛进行涡流 混合，混合后加人400μL5mol/L氢氧化钠溶液，并进行涡流混合30s。在80℃土5℃水浴中放置 1h。在此期间，要对每个测定样品进行两次涡流混合。1h后，将样品从水浴中取出并冷却至室温。加 人12mL特丁基甲醚，置于振荡器上高速振荡15min，离心15min（转速为5000r/min）。吸出上清 液，将特丁基甲醚定量转移到干净的15mL的玻璃离心管内，待净化。 7.1.2奶粉样品 称取奶粉样品0.25g（精确到0.01g），放人50mL聚丙烯离心管中，加人1.75g水超声溶解得到 复原乳，加人200μL乙睛，以下步骤同7.1.1。 7.2净化 在上述15mL离心管中加人1mol/L磷酸二氢钾溶液（pH=3.0)3mL，振荡10min，离心10min （5000r/min）。将特丁基甲醚层吸出弃去。在磷酸盐溶液中加入2mL特丁基甲醚，振荡5min，离心 5min(5000r/min），吸出特丁基甲醚层弃去。然后再在磷酸盐缓冲溶液中加入2mL特丁基甲醚重复 上述步骤。加人1mL5mol/L氢氧化钠溶液摇匀后加人10mL特丁基甲醚，振荡15min，离心5min （5000r/min）。定量吸取特丁基甲醚转移到一个干净的10mL的离心管中。在40C条件下用氮吹仪 蒸发至干。在浓缩至干的提取物中加人1000μL流动相溶液（4.17），进行涡流混合，超声处理10min。 用0.2μm×13mm的聚四氟乙烯注射式过滤器过滤样液，将样液转移到试样瓶中，供液相色谱-串联质 谱测定。 7.3色谱测定 7.3.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： a） 色谱柱：InertsilODS-3，5um，150mmX2.1mm（内径）或相当者； 柱温：35℃C； c) 进样量：20μL； 色谱柱总流量：200μL/min； e) 流动相及梯度见表1。 表1流动相及梯度 步 骤 运行时间/min 流动相A/% 流动相B/% 流动相C/% 0 0.00 70 15 15 1 4.00 70 15 15 2 9.00 40 15 45 3