ICS 67.050 X 04 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T 22994—2008 牛奶和奶粉中左旋咪唑残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of levamisole residues in milk and milk powder- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22994—2008 前言 本标准附录A、附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国青海出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：薄海波、離丽丽、光群、曹彦忠、赵青、庞国芳。 GB/T22994—2008 牛奶和奶粉中左旋咪唑残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛奶和奶粉中左旋咪唑残留量液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于液态奶（包括原料奶、纯牛奶、脱脂牛奶）和奶粉（包括纯奶粉、脱脂奶粉和婴幼儿配方 奶粉）中左旋咪唑（levamisole）残留量的测定。 本标准牛奶中左旋咪唑检出限为0.4μg/kg；奶粉中左旋咪唑检出限为3.2ug/kg 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1一 2004,ISO 5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994，IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD） 3原理 在碱性环境下用乙酸乙酯提取试样中的左旋咪唑残留，用稀盐酸将提取液中左旋咪唑转化为盐酸 左旋咪唑并反提到盐酸层，强阳离子交换固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯。 4.1水:GB/T6682,一级。 4.2 乙酸乙酯：色谱纯。 4.3 乙腈：色谱纯。 4.4甲醇：色谱纯。 4.5 氢氧化钠。 4.6 浓盐酸。 4.7 氨水。 4.8 氯化钠。 4.9无水硫酸钠：用前在650℃灼烧4h，置于干燥器中冷却后备用。 4.10甲酸：优级纯 4.110.1%甲酸溶液：取1mL甲酸，用水定容至1000mL。当天配制。 4.120.2mol/L盐酸溶液：取18mL盐酸（4.6）,用水定容至1000mL。 4.13 310mol/L氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠（4.5），用水溶解并定容至100mL。 4.14氨水-甲醇溶液（1+3）：量取50mL氨水（4.7）与150mL甲醇（4.4）混合，摇勺。 1 GB/T22994—2008 4.15盐酸左旋咪唑标准品（levamisolehydrochloride，CAS：16595-80-5）：纯度>98%。 4.16标准储备溶液：准确称取适量的标准品，用甲醇（4.4）溶解、转移至50mL棕色容量瓶中并定容 至刻度。该溶液浓度为1mg/mL。储备液贮存在一18℃冰柜中，有效期为半年。 4.17标准中间溶液：吸取1.00mL标准储备溶液（4.16），移人100mL棕色容量瓶，用水定容，该溶液 浓度为10μg/mL。0℃~4℃冰箱保存 4.18标准工作溶液：根据需要吸取适量标准中间溶液（4.17），用流动相稀释至所需浓度，使用前配制。 4.19强阳离子交换固相萃取柱或相当者：3mL,500mg。使用前依次用甲醇3ml、水3mL和0.2mol/ml 盐酸1mL活化，保持柱体湿润。 4.20滤膜：0.2μm。 5仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 5.2 固相萃取净化装置。 5.3 分析天平：感量0.1mg,0.01g。 5.4 旋涡混匀器。 5.5 超声波清洗器。 5.6 离心机：带有50mL螺口聚内烯离心管。 5.7 移液器:1mL,2mL。 5.8氮气吹干仪。 5.9样品瓶:2mL。 6试样制备与保存 6.1试样的制备 从全部样品中取出有代表性样品约1kg，充分混匀，均分成两份，分别装人洁净容器内。密封后作 为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2试样的保存 将试样于4℃保存。 7测定步骤 7.1提取 7.1.1牛奶样品 称取10g混匀的试样（精确至0.01g）于50mL聚丙烯离心管中，加人10mol/mlL氢氧化钠0.1mL、 氯化钠（4.8）约5g和乙酸乙酯（4.2)20mL，涡旋混匀1min，振荡10min，以4000r/min离心10min。 取上层乙酸乙酯10mL于另一个50mL聚丙烯离心管中，加0.2mol/L盐酸20mL，振荡10min，以 2000r/min离心5min。取下层盐酸溶液10mL,待净化。 7.1.2奶粉样品 称取12.5g奶粉于烧杯中，加适量35℃～50℃水将其溶解，待冷却至室温后，用水定容至100mL， 充分混匀。量取10mL溶液于50mL聚丙烯离心管中，按7.1.1步骤提取。 7.2净化 SAC 将7.1所得的提取液10mL加载到SCX小柱，依次用水3mL、0.2mol/L盐酸1mL和甲醇3ml 淋洗，用氨水-甲醇溶液（4.14)4.0mL洗脱。用氮气吹干仪将洗脱液吹干，用流动相定容至1mL，过 0.2um滤膜。供液相色谱-串联质谱测定。 2 GB/T 22994—2008 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： 色谱柱：BEHCis，1.7μm，50mm×2.1mm（内径）或相当者； a) b) 流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液（3十17）； c) 流速0.25mL/min； 柱温：35℃； e) 进样量：5.0μL。 7.3. 2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 电离模式：ESI+； b) 检测方式：多反应监测（MRM)； c) 毛细管电压：2.5kV； d) 离子源温度：110℃； 去溶剂气温度：380℃； e) f) 去溶剂气（氮气）流量：600L/h； g) 锥孔气（氮气）流量（Nz）：40L/h； h) 碰撞气（氩气）流量：0.1L/h； i) 定性离子对、定量离子对和碰撞能量等参数见表1。 表1定量离子对、定性离子对和碰撞能量等参数 定性离子对 定量离子对 碰撞能量/ 驻留时间/ 锥孔电压/ 化合物中文名称 化合物英文名称 (m/z) (m/z) V ms V 205/92 38 300 40 左旋咪唑 levamisole 205/92 205/179 20 300 40 7.4测定 7.4.1定性测定 样品溶液按照液相色谱-串联质谱分析条件进行测定时，如果检出的色谱峰保留时间与标准溶液中 左旋咪唑的保留时间偏差在土2.5%之内，在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的两对定性对均出现， 而且离子对丰度比与浓度接近的标准溶液谱图中离子相对丰度比偏差不超过规定的范围（见表2），则 可以判断样品中存在左旋咪唑。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 % 相对离子丰度K K>50 20<K<50 10<K<20 K≤10 允许最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.4.2定量测定 用混合标准工作溶液（4.18）进样，以工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线 待测样液等体积进样测定。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中左旋咪唑的响应值应在检测 的线性范围内。在上述液相色谱-串联质谱分析条件下，左旋咪唑的参考保留时间约为1.2min。左旋 咪唑标准物质多反应监测（MRM)色谱图参见附录A中图A.1。左旋咪唑的添加浓度和回收率实验数 据参见附录B中的表B.1。 7.5平行试验 按以上步骤对同一试样进行平行试验测定。 3