ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T22980—2008 牛奶和奶粉中氟胺烟酸残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 Determination of flunixin residue in bovine milk and milk powder- LC-UV method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22980—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：宋文斌、李军、李一尘、赵景红、于一范、李百、于杰、李叶、庞国芳 GB/T22980—2008 牛奶和奶粉中氟胺烟酸残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 1范围 本标准规定了原料乳和纯奶粉中氟胺烟酸（flunixin）残留量的液相色谱-紫外检测方法。 本标准适用于原料乳和纯奶粉中氟胺烟酸残留量的测定。 本标准的方法检出限：原料乳为5.0ug/L，纯奶粉为40μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研 究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1一 2004,ISO 5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2：1994,IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD 3原理 样品在酸性条件下酶解用乙睛提取后，经正已烷和固相萃取柱净化，通过配置紫外检测器的高效液 相色谱进行分析测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所有试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲酸。 4.2冰乙酸。 4.3β-葡萄糖苷酸酶（βglucuronidase)15000U/mL:β葡萄糖苷酸酶（600000U/g），准确称取 0.0500gβ-葡萄糖苷酸酶，加2mL的磷酸盐（PBS)缓冲溶液溶解，用0.45μm尼龙滤膜过滤。使用 前现配制。 4.4葡萄糖。 4.5浓盐酸。 4.6流动相A：乙酸铵0.05mol/L，pH5.0（准确称取3.90g乙酸铵，加水溶解并用甲酸调整至 pH5.0,转移至1000mL容量瓶中，使用前过0.45μm滤膜）。 4.7流动相B.甲醇，色谱纯。 4.8流动相C:乙腈，色谱纯。 4.9混合流动相：将40mL流动相B，30mL流动相C以及30mL流动相A相混合 4.10磷酸盐（PBS)缓冲溶液：称取0.8g氯化钠，0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,0.115g磷酸氢 二钠和0.02g葡萄糖于250mL烧杯中加约90mL的水溶解，用0.1mol/L磷酸调整pH6.0，转移至 100mL容量瓶中并稀释至刻度。 1 GB/T22980—2008 4.1185%磷酸。 4.12乙酸钾溶液：0.04mol/L。称取1.95g乙酸钾于500mL容量瓶中，加约450mL水溶解并稀释 至刻度。 4.13氯化钾。 4.14磷酸二氢钾。 4.15磷酸二氢钾缓冲溶液：0.25mol/LpH7.0。称取17.01g磷酸二氢钾溶于400mL水中，定容到 500mL，然后用0.25mol/L磷酸氢二钠调节pH至7.0（约500mL），定容到1L。 4.16氯化钠。 4.17无水磷酸氢二钠。 4.18磷酸氢二钠溶液：0.25mol/L。称取17.75g磷酸氢二钠溶于400mL水中，定容到500mL。 4.19 正已烷：色谱纯。 4.20 乙酸-正已烷溶液：乙酸十正已烷（1十9）。 4.217 标准物质：氟胺烟酸葡甲胺盐，纯度>99%。 4.22 氟胺烟酸标准储备溶液：50μg/mL。称取适量的氟胺烟酸葡甲胺盐（4.21），用甲醇溶解并定容。 2℃～4℃下保存。 注：称取标准物的重量是按纯度和含盐量修正过的质量 4.23氟胺烟酸标准工作溶液：2μg/mL。吸取适量的氟胺烟酸标准储备溶液（4.22），用甲醇配制成 2μg/mL的标准工作溶液，2℃～4℃下保存。 4.24标准基质溶液：根据氟胺烟酸的灵敏度和仪器线性范围用空白样品提取液配制成不同浓度的标 准基质溶液。 5仪器 5.1液相色谱仪：配有紫外检测器。 5.2电子天平：感量为0.01g和0.0001g。 5.3 3离心机：最大转速为10000r/min。 5.4离心管：50mL聚丙烯离心管。 5.5 高速涡流混合器。 5. 6 振荡器。 5.7 微量移液器：10μ~100μl和1000μl~5000μ。 5.8 氮气浓缩仪。 5. 9 酸度计：精度为士0.02。 5.10 样品过滤器：PTFE，0.45μm。 5.11 固相萃取柱：BondElutCertifyⅡl，3mL，200mg，或相当者。 5. 12 真空固相萃取真空装置 5.13 超声波仪。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 将原料乳和纯奶粉样品分别混合均匀。各自分出0.5kg作为试样，将分出的试样密封，并作上 标记。 6.2试样保存 将试样置于4℃条件下贮存。 2 GB/T22980—2008 7分析步骤 7.1提取 7.1.1原料乳样品 称取原料乳试样2.00mL，精确到0.01mL放人50mL聚丙烯离心管中，加人乙酸钾溶液（4.12） 5mL，高速涡旋混合10s。混合后向样品中加入30L乙酸（4.2），调节样品pH至4.5，涡旋混合。再 加人70μL新配制的β-葡萄糖苷酸酶溶液（4.3）混合，于振荡器37℃条件下低速振荡16h。分别向样 品中加入5mL乙睛，涡旋混合5s，离心10min（5000r/min）。转移上清液至50ml离心管中。在原 液中加人5mL乙睛和1mL乙酸钾溶液（4.12）涡旋混合5s，离心10min（5000r/min），将上清液转移 至50mL离心管中，合并上清液，待净化。 7.1.2纯奶粉样品 称取纯奶粉0.25g，精确到0.01g，放人50mL聚丙烯离心管中加入1.75g水超声溶解得到复原 乳。加人乙酸钾溶液（4.12）5mL，以下步骤同原料乳样品， 7.2净化 在混合的上清液中加人5mL正已烷和50μL浓盐酸，涡旋混合15s，在5000r/min下离心5min。 弃去正已烷层，重复上述步骤一次。55℃条件下氮吹使其体积小于5mL。加人磷酸二氢钾缓冲液 （4.15）7mL，涡旋混合，超声20s，5℃条件下以5000r/min离心15min。采用固相萃取柱（5.11），用 3mL甲醇和3mL水活化柱，将样品过柱，弃去过柱液，然后用3mL水和6mL甲醇洗柱，弃去过柱液。 加大真空度抽滤10min。用2mL正已烷淋洗柱子两次并弃去淋洗液。用2mL乙酸-正已烷（4.20）洗 涤柱子两次，用15mL离心管收集洗涤液。在55℃条件下将洗涤液氮吹至干。随后，在每个样品中加 人混合流动相（4.9）1mL，涡旋混合5s，超声5s。样液用0.45um的滤膜过滤到进样瓶中，待测 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： a)1 色谱柱：Inertsil DS-3,5μm，250mmX4.6mm(内径)或相当者； b) 流速：0.4mL/min； c) 检测波长：285nm； d) 柱温：35℃； e) 进样量：20μL； f) 运行时间：30min。 7.3.2液相色谱测定 用氟胺烟酸的标准基质溶液（4.24)分别进样，以峰面积和工作标准溶液浓度绘制标准工作曲线，样 品溶液中氟胺烟酸的响应值应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，氟胺烟酸保留时间为 14min，标准物质色谱图参见附录A中的图A.1。氟胺烟酸的添加浓度及其平均回收率的试验数据参 见附录B中的表B.1。 7.4平行试验 按照上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。 7.5空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。 8结果计算 试样中氟胺烟酸的残留量的测定按式(1)计算： 3