ICS11.040.55 C 30 中华人民共和国国家标准 GB/T35029—2018 基于微阵列芯片的遗传性 耳聋基因检测方法 Method based the microarray for mutation detetion of hereditary hearing loss 2018-12-01实施 2018-05-14发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 35029—2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国生物芯片标准化技术委员会（SAC/TC421)提出并归口。 本标准起草单位：博奥生物集团有限公司。 本标准主要起草人：蒋迪、项光新。 GB/T350292018 基于微阵列芯片的遗传性 耳聋基因检测方法 1范围 本标准规定了基于微阵列芯片的常见遗传性耳聋基因检测的操作方法。 本标准适用于临床辅助诊断、新生儿筛查、流行病学调查、健康人筛查等领域常见的遗传性耳聋相 关基因位点的检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27990—2011生物芯片基本术语 YY/T1153体外诊断用DNA微阵列芯片 YY/T1154激光共聚焦扫描仪 3 术语和定义 GB/T27990一2011界定的术语和定义适用于本文件。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） GJB2：缝隙连接蛋白β亚基2（gapjunctionbeta2） GJB3：缝隙连接蛋白β亚基3(gap junctionbeta 3) PCR：聚合酶链式扩增（polymerasechainreaction） SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate） SLC26A4：溶质转运蛋白26成员4（solutecarrierfamily26，member4) SSC：柠檬酸盐缓冲液（citratebuffersolution） 5 原理 根据现已发现并基于我国人群聋病流行病学调查确证的遗传性耳聋基因突变位点信息，采用多重 扩增及芯片杂交技术对中国人群中常见的遗传性耳聋基因突变位点进行检测。 1 GB/T35029—2018 以人基因组DNA为模板，采用合适引物对相关基因位点所在基因片段进行扩增和荧光标记，然后 依据碱基互补配对原则，与能够识别该序列的基因芯片进行杂交，最后进行芯片扫描和数据分析。由于 针对所检测的多个位点的野生型和突变型分别设计了引物和探针，因此可以同时检测出多个位点的野 生型和突变型结果。 6材料 6.1仪器设备 符合YY/T1154要求并获得医疗器械注册证书的微阵列芯片扫描仪、核酸微量离心机、离心管、恒 温摇床、芯片洗干仪（备选）、微量加样器及加样器吸头、微量离心机、离心管、恒温摇床、芯片洗涤容 器等。 6.2 2试剂 本方法中需要的试剂可以是单独的试剂，也可以是已获得医疗器械注册证书的等效试剂盒中的 试剂。 6.2.1水 本方法中所用水为GB/T6682规定的三级水。 6.2.2引物、探针 针对检测位点设计针对各位点相应的上游引物和下游引物，以及针对各位点的检测探针，常见的遗 传性耳聋相关基因位点应包括表1中的基因位点及突变形式。 S表1 常见遗传性耳聋相关基因位点 突变所在基因 突变所在位点 突变位点描述 35 35 del G 176 176_191 del 16 GJB2 235 235 del C 299 299_300 del AT GJB3 538 C>T 1494 1494 C>T 线粒体12SrRNA 1555 1555 A>G 1174 1174 A>T 1226 1226 G>A 1229 1229 C>T 1975 1975 G>C SLC26A4 2027 2027T>A 2168 2168 A>G IVS7-2 IVS7-2 A>G IVS15+5 IVS15+5G>A 2 GB/T35029—2018 6.2.3TaqDNA聚合酶缓冲液 分子生物学级。 6.2.4 dNTP溶液 包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合物 6.2.5 MgCl2溶液 分子生物学级 6.2.6 TaqDNA聚合酶 本方法中宜采用热启动TaqDNA聚合酶。 6.2.7 10%SDS 分析纯。 6.2.8 20×SSC 分析纯。 6.2.9 去离子甲酰胺溶液 分析纯。 6.2.10 50×Denhart's溶液 分析纯。 6.3 微阵列芯片 本方法中所使用的微阵列芯片应符合YY/T1153要求。 7 样本采集与处理 7.1采集 7.1.1全血标本 当上游标本是人全血时，其适用抗凝剂应为EDTA或枸橡酸钠等，不得以肝素抗凝；被检者服药情 况、饮食及健康状态不影响标本采集和结果检测。 7.1.2滤纸干血斑 当上游标本是人滤纸干血斑时，其采集应符合采血常规和管理规范 7.1.3 口腔拭子细胞 当上游标本是口腔黏膜细胞时，其采集方法应参照常规口腔黏膜细胞采集方法进行。 3 GB/T35029—2018 7.2 2基因组DNA提取 7.2.1全血标本 对血液标本,DNA提取以新采集血液为宜,应采用血液核酸提取试剂盒进行基因组DNA提取。 7.2.2滤纸干血斑 对滤纸干血斑标本，用打孔器取若干个干血斑，应采用干血斑核酸提取试剂盒进行DNA提取。 7.2.3口腔拭子细胞 对于标本是口腔黏膜细胞时，应采用口腔拭子细胞核酸提取试剂盒进行DNA提取。 对于其他类型样本，宜采用适宜的处理方式 7.3保存 7.3.1全血标本 血液的保存：采集的血液在2℃～8℃保存不应超过一周；一20℃保存不应超过一个月。 7.3.2滤纸干血斑 滤纸干血斑保存：室温干燥保存不应超过1年。 7.3.3口腔拭子细胞 口腔拭子保存：采集的口腔拭子应尽快检测；需要保存时，应室温干燥后密封保存。 7.3.4基因组DNA 基因组DNA的保存：待测标本在2℃～8℃保存不应超过一周；一20℃保存不应超过一个月； 一80℃可长期保存。避免反复冻融。 7.4运输 7.4.1全血标本 血液的运输宜采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。 7.4.2滤纸干血斑 滤纸干血斑宜晾干后密封进行常温运输。 7.4.3口腔拭子细胞 口腔拭子宜晾干后密封进行常温运输。 8操作方法 8.1核酸提取 可使用各种经过验证不影响后续检测步骤的提取方法。提取后，将所得DNA采用荧光分光光度 计进行定量。若采用已获得医疗器械注册证书的等效试剂盒进行检测时，需将DNA稀释至试剂盒检 4 GB/T35029—2018 测浓度范围。 8.2检测 8.2.1配制DNA扩增反应体 将水PCR缓冲液、引物、dNTP、MgCI2、TaqDNA聚合酶等按照一定比例混匀，即成PCR扩增体 系。本步骤也可采用已获得医疗器械注册证书的等效试剂盒进行扩增体系的配制。本标准中所说常见 遗传性耳聋相关基因位点见表1。 8.2.2加入待检测样品 配制好的扩增体系中加入被检测的基因组DNA作为扩增模板，放入PCR扩增仪中进行PCR反 应；为监控实验过程是否正常，在该步骤中宜平行加入阳性对照品和阴性对照品进行同步扩增反应 8.2.3扩增反应 将加人模板的扩增体系置于PCR扩增仪中，设定热循环程序，进行DNA扩增反应。PCR反应程 35个～40个循环72℃延伸10min，结束反应过程。如采用已获得医疗器械注册证书的等效试剂盒进 行检测，扩增反应程序按试剂盒操作说明书进行。 8.2.4芯片杂交 8.2.4.1杂交反应混合物的配制 将一定量的去离子甲酰胺、10%SDS、20XSSC、50XDenhart's溶液、纯化水，按照去离子甲酰胺 25%40%、1%SDS、2XSSC、5XDenharts的终浓度按比例混匀配制成杂交缓冲液。取适量杂交缓 冲液与8.2.3扩增后的产物混合，配制成杂交反应混合物。杂交反应混合物中杂交缓冲液与扩增产物 混合的比例可采用2：1。 8.2.4.2杂交反应 在芯片上加人杂交反应混合物。每个微阵列限加一份相应的杂交反应混合物。记录芯片编号及对 应的样品编号。立即将芯片放入已预热到杂交温度的恒温水浴锅或芯片杂交仪中杂交。杂交温度可采 用50℃～60℃。如采用已获得医疗器械注册证书的等效试剂盒进行检测，杂交温度参照试剂盒操作 说明书设置。 8.2.4.3芯片洗涤液的准备 根据芯片数量配制芯片洗涤液，芯片洗涤液宜用两种洗液进行，分别为洗液1和洗液2。芯片洗涤 0.3×SSC：洗液2成分为：0.15XSSC：配制后的洗液分别混合均匀后平衡至洗涤温度37℃～42℃。 8.2.4.4芯片的洗涤与干燥 杂交反应结束后，将芯片取出，进行芯片洗涤。芯片的洗涤可使用芯片洗干仪根据操作说明进行洗 涤；或手工洗涤，手工洗涤的条件为：将芯片放人洗液1，按转数80r/min～100r/min摇床摇洗2min； 再将芯片放入洗液2中，按转数80r/